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2022-10-22 19:34:57 By : Ms. Sunny Pan

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di legame competitivo ha consentito la determinazione delle costanti di dissociazione degli inibitori CA comuni per CAIX espresse in cellule tumorali a crescita esponenziale.Tutti i composti sulfamidici testati legavano le cellule proliferanti con affinità simile a quella del CAIX purificato in modo ricombinante.Le sonde sono applicabili per la progettazione di composti selettivi simili a farmaci per CAIX e la strategia di competizione potrebbe essere applicata ad altri bersagli farmacologici.Dalla scoperta che l'isoenzima IX dell'anidrasi carbonica (CAIX) è altamente sovraespresso in numerosi tumori1,2,3, specialmente nei tumori solidi ipossici, l'enzima è diventato un bersaglio della progettazione di farmaci antitumorali.CAIX è una proteina transmembrana che catalizza l'idratazione reversibile della CO2 in un anione bicarbonato e un protone acido, acidifica il microambiente delle cellule tumorali e promuove metastasi e invasività4,5,6.Gli esseri umani hanno 15 isoenzimi CA, dove CAI, CAII, CAIII e CAVII sono citosolici, CAIX, CAXII e CAXIV—transmembrana, CAIV—attaccati alla membrana tramite un residuo lipidico, CAVI—secreti, CAVA e CAVB—mitocondriali.CAVIII, CAX e CAXI sono isoenzimi cataliticamente inattivi perché lo Zn(II) è assente nel loro sito attivo7.Negli esseri umani sani, il CAIX è espresso principalmente nello stomaco e nei testicoli.Tuttavia, la sua espressione aumenta drammaticamente in numerosi tumori, tra cui carcinoma cervicale, carcinoma esofageo, tumore del pancreas, carcinoma renale, adenocarcinoma dell'endometrio, tumore ovarico, carcinoma della vescica urinaria, adenocarcinoma del colon, tumore del polmone, carcinoma del fegato, adenocarcinoma mammario, carcinoma a cellule squamose del testa e collo e altri8,9.I composti che presenterebbero un'elevata affinità e selettività per CAIX avrebbero un potenziale terapeutico promettente.Inoltre, le sonde fluorescenti selettive CAIX10,11 o PET12 potrebbero visualizzare il tumore per la chirurgia otticamente guidata o la stratificazione del paziente.Abbiamo progettato e valutato una serie di composti che legano CAIX con affinità da 10 pM a 50 pM e hanno mostrato selettività da 30 a 100.000 volte rispetto ad altri isoenzimi CA13,14,15,16,17,18.Per possedere un'elevata affinità, i fluoro dovevano essere introdotti nell'anello benzenico direttamente attaccato al gruppo di testa sulfonamidico che lega lo Zn(II) nel sito attivo di CA.Questi fluoro ritirano gli elettroni dal gruppo sulfamidico e diminuiscono il suo pKa portando ad un aumento dell'affinità.La selettività del composto per CAIX viene aumentata introducendo un gruppo idrofobico voluminoso come meta sostituente nell'anello benzenico rispetto al gruppo sulfamidico.Tuttavia, è stato dimostrato che questi composti legano selettivamente il CAIX purificato, ma non è stato dimostrato che riconoscano il CAIX nell'ambiente cellulare in presenza di migliaia di altre proteine ​​concorrenti.Dopo la dimostrazione da parte di Whitesides e collaboratori che vari sostituenti possono essere introdotti negli inibitori delle sulfamidici CA, esaminati in19, sono state sintetizzate varie sulfonamidi marcate con sonde fluorescenti.La naftalen sulfonammide è stata utilizzata come gruppo fluorogenico20, la fluoresceina è stata attaccata a benzene sulfamidico para- o meta-sostituito o acetazolamide10,11,21,22,23.La rodamina24 e i coloranti a infrarossi sono stati attaccati all'acetazolamide9,25,26,27 per visualizzare le anidrasi carboniche, in particolare per seguire l'espressione di CAIX nelle colture cellulari e nei tumori dei topi.I test di spostamento del colorante fluorescente sono stati utilizzati per determinare l'efficacia dell'inibitore per CAII19,28 bovino.Qui abbiamo progettato una serie di composti coniugando la fluoresceina con inibitori ad alta affinità selettivi CAIX.La fluoresceina è stata attaccata a VD11-4-2 con alta affinità per CAIX e anche altri composti che possiedono affinità medie o basse per CAIX come controlli per tenere conto del legame non specifico.Questi composti fluorescenti non solo hanno aiutato a visualizzare l'espressione di CAIX nelle cellule tumorali, ma sono anche diventati la base di una tecnica per determinare le costanti di dissociazione dei comuni inibitori CAIX non fluorescenti attraverso la competizione con composti marcati con fluoresceina.Abbiamo dimostrato che gli inibitori testati mostravano affinità comparabili tra il CAIX prodotto in modo ricombinante e il CAIX sulla superficie cellulare delle cellule tumorali vive.La dinamica dell'aspetto di CAIX sulle cellule tumorali è stata visualizzata e quantificata.La microscopia a super risoluzione ha dimostrato la co-localizzazione di composti marcati in modo fluorescente con gli anticorpi CAIX.Una serie dei nostri composti precedentemente progettati, che hanno dimostrato di legare il CAIX umano con alta affinità (Kd ~ 30 pM) e alta selettività sui restanti 11 isoenzimi CA umani cataliticamente attivi14, sono stati etichettati con fluoresceina come descritto nella parte dei metodi.Le strutture chimiche di tutti i composti utilizzati in questo studio sono mostrate in Fig. 1. Per preparare il composto di piombo GZ19-32, la fluoresceina è stata coniugata alla coda della molecola VD11-4-2, esposta verso il solvente come mostrato dalla cristallografia16.Strutture chimiche di composti marcati con fluoresceina (riga superiore) e diversi composti non marcati (riga inferiore).Le loro affinità per CAIX sulla superficie cellulare sono state misurate mediante il test di competizione (descritto di seguito).L'ammina del gruppo sulfamidico è mostrata in blu, mentre il metile per i non inibitori è in rosso.La fluoresceina è mostrata in verde e il linker esteso in rosa.Poiché c'era la preoccupazione che la presenza di fluoresceina su un linker corto potesse ostacolare il legame di un tale coniugato a CAIX, abbiamo sintetizzato un altro composto, GZ20-40, con un linker più lungo tra la fluoresceina e VD11-4-2 (Fig. 1) .Inoltre, abbiamo sintetizzato GZ19-31, una molecola con fluoresceina attaccata a VD10-35, che ha un'elevata affinità per CAI e un'affinità relativamente bassa per CAIX.Inoltre, due composti di controllo, GZ20-37 e GZ19-33, sono stati sintetizzati identici ai composti GZ19-32 e GZ19-31, rispettivamente, tranne per il fatto che contenevano un gruppo metilico invece di un gruppo amminico nel gruppo di testa sulfonamidico.Ci si aspettava che entrambi i composti di controllo avessero una bassa affinità per qualsiasi isoenzima CA, inclusi CAIX ricombinante e CAIX endogeno espressi sulla superficie cellulare.Le affinità di legame di tutti i composti contenenti fluoresceina sono state determinate per tutti i 12 isoenzimi CA cataliticamente attivi mediante il test di spostamento termico (TSA).Inoltre, abbiamo utilizzato il test a flusso interrotto (SFA) per determinare se i composti hanno inibito l'attività catalitica degli isoenzimi CA.Tuttavia, la tecnica SFA non è in grado di determinare le affinità inferiori alla concentrazione enzimatica utilizzata nel test.Poiché abbiamo utilizzato concentrazioni di 10-50 nM di isoenzimi CA, l'SFA non è stato in grado di determinare le affinità nell'intervallo pM.Inoltre, abbiamo utilizzato la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), il test standard per determinare l'affinità e l'entalpia del legame proteico-ligando.Tuttavia, l'ITC diretto ha una limitazione che può determinare affinità fino a circa 10 nM Kd.Pertanto, l'ITC è stato utilizzato solo per determinare l'entalpia di interazione e confermare l'ordinamento delle affinità dei composti.Secondo i nostri risultati TSA, GZ19-32 possedeva un'elevata affinità per CAIX (intervallo pM).Il GZ19-31 selettivo CAI aveva un'affinità media (intervallo nM) per CAIX (Fig. 2).Lo stesso ordine è stato confermato da ITC (Figura S1).L'affinità di legame di GZ19-31 era paragonabile all'affinità determinata da TSA e SFA.L'analogo composto di controllo metilato GZ20-37 non ha mostrato legame a CAIX da parte di TSA o ITC, ma ha inibito debolmente l'attività CAIX (Ki = 1,5 µM).Le affinità composte per il dominio catalitico ricombinante purificato di CAIX umano e altre isoforme sono elencate nella Tabella 1. Abbiamo concluso che il GZ19-32 marcato con fluoresceina lega il CAIX ricombinante con la stessa affinità di VD11-4-2 e GZ18-23 senza etichetta.Pertanto l'aggiunta dell'etichetta della fluoresceina non ha influenzato il legame del composto di piombo e GZ19-32 può essere utilizzato come reporter selettivo per CAIX.Determinazione delle affinità dei composti marcati con fluoresceina per il dominio catalitico del CAIX umano ricombinante da parte del TSA (pannelli di sinistra) e dell'SFA (pannelli di destra).Le tre righe superiori mostrano i dati di rilegatura grezzi per GZ19-32 (nero), GZ19-31 (blu) e GZ20-37 (arancione).(A, B e C) I profili di fluorescenza sulla fusione termica delle proteine.(E, F e G) La diminuzione dell'assorbanza dovuta al cambiamento di colore dell'indicatore di pH in seguito all'acidificazione da parte di CAIX nel test SFA.La linea tratteggiata "CAIX saturo di ligando" corrisponde alla linea osservata per l'idratazione spontanea di CO2.I pannelli inferiori mostrano le curve di dosaggio di TSA (D) e SFA (H).L'SFA è limitato all'affinità che è vicina alla concentrazione di CA utilizzata nel test enzimatico.Pertanto, solo la TSA ha prodotto valori Kd accurati nell'intervallo di affinità pM.Per visualizzare il legame dei composti marcati con fluoresceina alle cellule vive, abbiamo eseguito la microscopia di cellule incubate con GZ19-32 (Fig. 3, Figura S2).Il GZ19-32 selettivo CAIX ha etichettato la membrana cellulare, ben visibile nelle cellule confluenti (pannello superiore sinistro rispetto al quarto pannello superiore, Figura S2), mentre il GZ20-37 metilato non si è legato alle cellule nelle stesse condizioni (Figura S2, Fig. 3).La terza colonna in Fig. 3 mostra la colorazione cellulare con l'anticorpo monoclonale CAIX H731.Colorazione con GZ19-32 perfettamente co-localizzata con la colorazione con l'anticorpo (quarta colonna).La prima colonna mostra la colorazione del DNA nei nuclei.Si trattava di una determinazione visiva diretta del legame e della colorazione del composto specifico di CAIX espresso sulla membrana delle cellule tumorali in ipossia.Colorazione di cellule HeLa vive (cresciute in ipossia o normossia) incubate con 10 nM GZ19-32 o GZ20-37 che mostrano nuclei cellulari (Hoechst 33342, blu), legame dei composti GZ (verde), anticorpi CAIX (rosso) e loro colocalizzazione .La lunghezza della barra della scala è di 10 µm.Nelle singole cellule, è stato osservato che il GZ19-32 marcato con fluoresceina si localizza nella filopodia e nei fili che collegano le cellule e anche in altri punti della membrana cellulare indicando la localizzazione di CAIX (Fig. 4).La microscopia Super-Resolution Radial Fluctuations (SRRF) nell'illuminazione in modalità TIRF ha mostrato GZ19-32 in punti ben distinti che contengono almeno 10 molecole di CAIX per agglomerato (stime conservative dovute alle tracce temporali osservate di fotosbiancamento uniforme senza un chiaro comportamento a gradini , Fig. 5).Il colorante selettivo CAIX marcato con fluoresceina GZ19-32 formava le macchie verdi, mentre la stessa localizzazione dell'anticorpo H7 era visibile nel canale rosso.La sovrapposizione indicava che il composto e l'anticorpo erano co-localizzati quasi perfettamente.Tutte le tecniche di collocalizzazione multicolore utilizzate indicavano un alto grado di colocalizzazione, vale a dire, il coefficiente di correlazione della Persona basato sui pixel era 0,82 e i coefficienti di sovrapposizione di Manders erano M1 0,82 e M2 0,65 e la collocalizzazione spot basata sull'oggetto era 0,75.La dimensione di ciascun punto era inferiore a 100 nm di diametro ed era ben separata da distanze simili da 0,7 a 1,8 µm.Osservazioni simili sono state ottenute con una minore concentrazione di GZ19-32 (2 nM, Figura S3).La localizzazione di GZ19-32 (10 nM, verde) in cellule HeLa vive cresciute in ipossia mostra che CAIX è espresso sulla membrana cellulare, principalmente sulla filopodia.La lunghezza della barra della scala è di 10 µm.Qui, le stesse due cellule della Fig. 4, sono mostrate a super risoluzione, visualizzate mediante microscopia SRRF con illuminazione TIRF e illustrano il posizionamento dell'anticorpo GZ19-32 (verde, (B), CAIX (C) e il loro colocalizzazione (D).La barra della scala è 10 µm in (A) e 1 µm in (B), (C) e (D).La colocalizzazione tra GZ19-32 e CAIX è stata dimostrata anche con un altro anticorpo monoclonale specifico per CAIX M75 (Figura S4 A, B).Al contrario, non sono state osservate macchie gialle di colocalizzazione quando è stato utilizzato l'anticorpo 1B10, specifico per un altro isoenzima CAXII 32 associato alla membrana (Figura S4 C, D) o quando l'anticorpo primario è stato omesso nella procedura di colorazione (Figura S4 E, F).Per studiare ulteriormente il legame e la selettività dei composti fluorescenti progettati per il CAIX cellulare, abbiamo deciso di eliminare il CAIX nelle cellule tumorali.La metodologia CRISPR-Cas9 è stata applicata per generare le cellule HeLa knockout CAIX (CAIX-KO) come descritto nella parte relativa ai metodi.Il knockout CAIX nelle cellule HeLa è stato confermato mediante sequenziamento e colorazione cellulare con immunofluorescenza, Western blot (WB) e citometria a flusso utilizzando anticorpi per CAIX (Fig. 6).Convalida delle cellule HeLa knockout CAIX.(A) Colorazione di immunofluorescenza con anticorpo H7 di cellule HeLa WT e HeLa CAIX-KO coltivate in ipossia.La colorazione verde delle membrane cellulari che esprimono CAIX è visibile solo nelle cellule WT.(B) Western Blot di HeLa WT e HeLa CAIX-KO cellule cresciute con ipossia utilizzando l'anticorpo monoclonale M75 e l'anticorpo anti β-tubulina come controllo di caricamento, ha dimostrato l'assenza di espressione CAIX nelle cellule KO.La membrana a tutta lunghezza è mostrata nella figura supplementare S5.(C) L'intensità media di fluorescenza (MFI) ottenuta dalla citometria a flusso di linee cellulari Hela WT o Hela CAIX-KO cresciute in normossia o ipossia.Vengono mostrati i valori medi di due esperimenti, che indicano la presenza di CAIX solo nelle cellule WT HeLa cresciute solo in ipossia.CAIX-KO è stato anche convalidato misurando l'inibizione dell'attività CA nelle cellule vive da parte di un inibitore di CAIX, il GZ18-23.Il composto ha mostrato una forte inibizione dell'attività CA mediante la spettrometria di massa dell'analisi dei gas nelle cellule ipossiche HeLa WT, ma non vi è stato alcun effetto nelle cellule ipossiche HeLa CAIX-KO (Fig. 7).Inibizione dell'attività enzimatica di CA da parte di GZ18-23 in colture cellulari ipossiche HeLa WT e CAIX-KO vive mediante spettrometria di massa di analisi dei gas.(A) Inibizione dell'attività CA da parte dell'inibitore GZ18-23 nelle cellule HeLa ipossiche.(B) Confronto dell'attività CA mediante analisi dei gas MS di colture cellulari ipossiche HeLa WT e CAIX-KO.(C) Vitalità delle cellule HeLa ipossiche dopo l'applicazione dell'inibitore GZ18-23.Il composto GZ18-23 è stato progettato per mantenere l'affinità verso CAIX del nostro VD11-4-2 precedentemente scoperto.Il nuovo inibitore aveva la stessa struttura chimica di VD11-4-2 tranne per il fatto che il gruppo ossidrile è stato sostituito con il gruppo carbossilico che ne ha migliorato la solubilità in acqua e le proprietà farmacocinetiche (Fig. 1).L'inibitore è stato altamente efficace per inibire la maggior parte dell'attività CA (Fig. 7A).Sotto l'ipossia, le cellule HeLa esprimono numerosi isoenzimi CA.Poiché l'inibitore GZ18-23 possiede un'elevata selettività solo per CAIX, l'applicazione dell'inibitore non ha inibito tutta l'attività CA.Come si vede in Fig. 7A, circa il 20% dell'attività complessiva di CA è rimasta disinibita dal composto.Questa attività rimanente era paragonabile all'attività CA nelle cellule HeLa CAIX-KO che non sono state influenzate dall'inibitore GZ18-23 (Fig. 7B).L'assenza di CAIX nelle cellule HeLa CAIX-KO è stata forse parzialmente compensata dall'aumentata attività complessiva di altri isoenzimi CA, come suggerito da un leggero aumento dell'attività CA nelle cellule CAIX-KO rispetto al WT (Fig. 7B).L'applicazione di una concentrazione fino a 1 µM di GZ18-23 ha inibito l'attività CA ma non ha influenzato la vitalità delle cellule HeLa ipossiche (Fig. 7C).Dopo la conferma del legame del composto mediante microscopia, abbiamo tentato di determinare la forza quantitativa dell'interazione tra i composti marcati con fluoresceina e il CAIX espresso sulle cellule.Abbiamo eseguito una serie di esperimenti con varie concentrazioni dei composti applicati a cellule vive cresciute in piastre da 12 pozzetti per 72 ore e incubate per vari periodi di tempo e tensioni di ossigeno.Questi esperimenti hanno prodotto le affinità quantitative dei composti oltre alla visualizzazione al microscopio.L'applicazione del composto GZ19-32 a varie concentrazioni ha prodotto un aumento della fluorescenza dipendente dalla concentrazione (Fig. 8).Nell'intervallo di concentrazione del composto da 10 nM a 100 nM, la fluorescenza è aumentata solo per le cellule WT HeLa che sono state coltivate in condizioni ipossiche.Le cellule HeLa CAIX-KO cresciute in ipossia non hanno mostrato un aumento della fluorescenza dei composti legati alle cellule, coerentemente con le osservazioni al microscopio (Fig. 3).Dosaggio quantitativo dei composti marcati con fluoresceina alle cellule HeLa (cresciute per 72 ore in ipossia).Il dosaggio di GZ19-32 o GZ20-40 ha prodotto profili di dosaggio simili (punti dati) con le linee adattate all'equazione di Morrison.I valori di Kd per le mescole GZ19-32 e GZ20-40 selettive per CAIX erano simili e pari a 0,15 nM (vedi sotto).La posizione delle curve non indicava il Kd ma mostrava invece la concentrazione della proteina interagente (CAIX) pari a circa 5 nM in questa figura, come ottenuta dall'adattamento all'equazione di Morrison.Questo valore dipende dal tempo utilizzato per far crescere le cellule HeLa in ipossia.L'applicazione di piccole concentrazioni del ligando marcato in modo fluorescente GZ19-32 ha fatto sì che tutto si legasse a CAIX sulla superficie cellulare di HeLa.La saturazione è stata raggiunta ad una concentrazione di circa 10 nM.Le cellule legavano solo GZ19-32 e GZ20-40 che erano specifiche per CAIX e differivano solo per la lunghezza del linker, ed entrambe contenevano lo stesso gruppo di testa specifico per CAIX.Tuttavia, il ligando GZ19-31, che conteneva il gruppo di testa specifico per l'isoenzima CAI, non si legava alle cellule nelle stesse condizioni.Allo stesso modo, il composto GZ20-37, in cui il gruppo amminico sulfamidico è stato sostituito con il gruppo metilico, non ha legato CAIX in questa regione di concentrazione.Il legame è stato abolito anche per le cellule CAIX-KO HeLa (Fig. 8).Tuttavia, quando sono state applicate concentrazioni micromolari, tutti i composti sopra elencati si sono legati a tutte le cellule indicando che si è verificato un legame a bassa affinità o non specifico nell'intervallo di concentrazione micromolare (Fig. 9).A concentrazioni superiori a circa 100 nM, GZ19-32 ha iniziato a legarsi anche alle cellule WT HeLa cresciute con normossia e alle cellule CAIX-KO HeLa (Fig. 9A).Inoltre, il composto metilato GZ20-37 senza il gruppo sulfamidico (Fig. 9B) e GZ19-31 e GZ19-33 (Fig. 9C) legavano anche le cellule nell'intervallo di concentrazione micromolare.Tutti questi risultati indicano che i composti hanno mostrato un legame non specifico a siti diversi dalla proteina CAIX sulla membrana cellulare HeLa al di sopra di una certa soglia di concentrazione (da circa 200 nM a 2 µM, a seconda del tempo di incubazione).Profili di dosaggio dei composti GZ marcati con fluoresceina che mostrano il legame specifico di GZ19-32 a CAIX espresso solo su cellule WT HeLa cresciute in ipossia (che si verificano a 100 nM dopo 5 min di incubazione (A) ea 500 nM dopo 2 min di incubazione (B ) e il legame non specifico a bersagli sconosciuti diversi da CAIX da parte di tutti gli altri composti alle cellule HeLa WT e CAIX-KO cresciute sia in condizioni di ipossia che di normossia. (C) Legame non specifico di sulfamidici (GZ19-31) e composto non solfonammidico metilato (GZ19-33) dopo 20 minuti di incubazione.I profili di dosaggio del composto GZ19-32 sono stati determinati anche per le cellule WT HeLa cresciute in ipossia per 1-4 giorni (Fig. 10).Non è stato osservato alcun legame dopo 24 ore, ma dopo 48 ore si è verificato un legame che indica che è stata prodotta una quantità rilevabile di proteina CAIX.Un ulteriore sostanziale aumento del legame è stato osservato dopo 72 e 96 ore.Poiché le cellule hanno continuato a crescere per 96 ore (Fig. 10B), la quantità di GZ19-32 legata è stata normalizzata dal numero di cellule determinate dal conteggio cellulare risultando nel numero di molecole GZ19-32 legate per cellula (Fig. 10C) .A circa 80 h di crescita in ipossia, il numero di molecole GZ19-32 legate per cellula HeLa ha superato 1 milione.Quindi, supponendo che il numero di GZ19-32 legati rappresenti il ​​numero di molecole CAIX, c'erano circa un milione di molecole CAIX prodotte in media da ciascuna cellula HeLa.Il tasso di produzione di CAIX, seguito dal numero di molecole GZ19-23 legate, ha raggiunto circa 20mila molecole CAIX prodotte da ciascuna cellula all'ora (Fig. 10D).(A) I profili di dosaggio composti di GZ19-32 dopo la crescita di cellule HeLa per 24 (cerchi pieni), 48 (quadrati pieni), 72 (triangoli pieni) e 96 (diamanti pieni) in ipossia.L'asse delle ascisse mostra la concentrazione di GZ19-32 totale aggiunto alla soluzione, mentre l'ordinata mostra la parte di concentrazione del composto GZ19-32 legato come calcolato dalla fluorescenza.(B) Il tasso di crescita delle cellule HeLa seguendo la densità ottica a 650 nm.(C) Il numero di GZ19-32 legati per cella HeLa.(D) Il tasso di produzione CAIX di ciascuna cella HeLa all'ora in base ai dati nel pannello (C).La Figura 10A mostra la concentrazione legata di GZ19-32 in funzione della concentrazione del composto aggiunto.Pertanto il grafico può essere utilizzato per ricontrollare se la posizione della curva adattata sull'ascissa corrisponde alla posizione di saturazione sull'ordinata.Gli adattamenti di Morrison, secondo l'ascissa, hanno prodotto la concentrazione CAIX di 0,9 nM a 24 h, 5,4 nM a 48 h, 14 nM a 72 h e 23 nM a 96 h.Tuttavia, i valori di saturazione sull'ordinata erano 0,03 nM a 24 h, 0,6 nM a 48 h, 2,8 nM a 72 h e 5,5 nM a 96 h.Quindi c'era una significativa discrepanza tra i due approcci per stimare la concentrazione di CAIX.La precisione dell'adattamento Morrison è di circa più meno due volte ei valori di saturazione dipendono dalla precisione della calibrazione della fluorescenza.La mancata corrispondenza sembrava dipendere dalla tecnica e quindi la classifica sembra essere corretta.La posizione delle curve sull'ascissa non indicava l'affinità come spesso si assume in esperimenti di dosaggio simili, ma mostrava invece la concentrazione di CAIX.Possiamo stimare che la concentrazione di CAIX fosse di circa 0,3 nM a 24 h, 2 nM a 48 h, 6 nM a 72 h e 12 nM a 96 h.I profili di dosaggio dei composti di cui sopra hanno mostrato che nelle nostre condizioni di coltura cellulare erano necessari circa 10 nM per saturare il CAIX prodotto dalle cellule.I composti avevano un'affinità Kd di 0,1 nM, ma poiché la concentrazione calcolata di CAIX era 10 nM, sarebbe stato necessario aggiungere 10 nM per ottenere la saturazione e la piena inibizione dell'attività enzimatica del CAIX (Figg. 8 e 10).Pertanto, il Kd di 0,1 nM non può essere determinato direttamente da tali grafici di dosaggio.L'obiettivo successivo era determinare l'affinità Kd di qualsiasi inibitore CAIX incubandolo in una miscela con il composto marcato con fluoresceina.Qualsiasi composto non fluorescente può essere applicato variandone la concentrazione mantenendo costante la concentrazione del composto fluorescente.Quando una tale miscela di composto marcato e non marcato viene applicata alle cellule, il composto marcato con fluoresceina competerà con quello non marcato e il profilo di legame dipenderà dall'affinità e dalla concentrazione del composto non marcato.Nell'esperimento di competizione, la concentrazione del ligando GZ19-32 marcato in modo fluorescente è stata mantenuta costante a 10 nM in una serie di tubi mentre la concentrazione del composto non marcato (ad esempio, EA3-2, mostrato in Fig. 11) è stata variata di eseguire diluizioni seriali doppie.Sia i composti marcati con fluoresceina che quelli non marcati sono stati applicati simultaneamente come miscela a cellule HeLa cresciute in ipossia in piastre da 12 pozzetti.Dopo 20 minuti di incubazione, i ligandi non legati sono stati rimossi mediante lavaggio estensivo ed è stata misurata la fluorescenza cellulare rimanente.Come si vede in Fig. 11, a basse concentrazioni EA3-2 non era in grado di competere con il GZ19-32 fluorescente e quindi la fluorescenza era elevata.Il valore è diminuito in modo dose-dipendente all'aumentare della concentrazione di EA3-2.Determinazione della costante di legame di EA3-2 a CAIX espressa su cellule HeLa vive mediante competizione con GZ19-32 contenente fluoresceina.La concentrazione di GZ19-32 era costante a 10 nM mentre EA3-2 è stato dosato in due serie di diluizioni doppie in 12 fasi, la prima a partire da 80 µM e la seconda - da 80 nM.I composti GZ19-32 ed EA3-2 sono stati aggiunti insieme come miscela.Il modello di legame a sito singolo produrrebbe un Kd = 300 nM non corretto, mentre il modello competitivo avrebbe prodotto un Kd = 5,5 nM corretto.Entrambi i modelli sembrano adattarsi bene ai dati, ma solo il modello competitivo descrive correttamente la situazione.Osservando la curva di legame, può sembrare che il valore Kd atteso di EA3-2 debba essere posizionato vicino alla concentrazione corrispondente al 50% di saturazione, quindi a circa 300 nM (Fig. 11).Un modello Morrison a sito singolo ha determinato tale valore (linea nera continua).Tuttavia, questo approccio è incompleto perché è necessario tenere conto di 10 nM del composto fluorescente concorrente GZ19-32, che compete per lo stesso sito di legame.Solo dopo l'applicazione del modello di legame competitivo che tiene conto di tutti i componenti, abbiamo ottenuto il Kd corretto (KdA - l'affinità del componente A nel modello) di EA3-2 pari a 5,5 nM.Questo valore corrispondeva al Kd osservato per l'associazione EA3-2 al CAIX ricombinante (TSA Kd = 4,0 nM, Tabella 2).Pertanto, c'era una differenza di circa 100 volte nel risultato Kd tra il modello a sito singolo e il modello competitivo.Entrambi i modelli sembravano visivamente corrispondere perfettamente ai punti dati.Tuttavia, solo il modello competitivo ha prodotto i valori Kd corretti.La regressione dei parametri del modello ai dati di dosaggio ha mostrato che la concentrazione di CAIX nel sistema cellulare era 2,0 nM, il composto fluorescente concorrente GZ19-32 (componente B) legato con il KdB = 0,2 nM, mentre il composto di interesse EA3-2 (componente A) legato con il KdA = 5,5 nM.La diluizione del composto EA3-2 a 22 punti è stata preparata mediante due diluizioni seriali in 12 fasi in cui la prima è iniziata da 80 µM e la seconda è iniziata da 80 nM in due fasi.L'undicesimo punto della serie 80 µM coincideva con il primo punto della serie 80 nM e c'erano due punti di controllo a 0 nM da ciascuna diluizione.Tali diluizioni a 22 concentrazioni coprivano un'intera regione da micromolare a sub-nanomolare e producevano i valori Kd più accurati (Tabella 2).Una serie di composti è stata dosata in modo competitivo in una miscela con la concentrazione costante di GZ19-32 (10 nM) per determinare le loro affinità per il CAIX espresso in cellule.Le curve di concorrenza hanno mostrato profili ben definiti in cui i leganti più potenti hanno superato GZ19-32 a concentrazioni inferiori rispetto a quelli deboli (Fig. 12).Le curve di dosaggio competitive hanno mostrato forme simili ma sono state spostate a seconda dell'affinità del composto studiato.Le affinità dei composti studiati erano simili quando si somministravano alle cellule HeLa e A549 cresciute in ipossia che sono state incluse in questo studio per dimostrare che gli effetti non si applicano esclusivamente alle cellule HeLa.Dosaggio competitivo di diversi inibitori di CA alle cellule HeLa (A) e A549 (B) coltivate in ipossia in presenza di una concentrazione costante di 10 nM di GZ19-32 marcato con fluoresceina.(C) Confronto dei valori di Kd per il legame del composto al CAIX espresso sulla superficie cellulare viva con i valori ottenuti per il legame del composto al CAIX purificato mediante FTSA.Sono state testate due linee cellulari tumorali: HeLa (cerchi pieni) e A549 (quadrati blu aperti).La linea diagonale continua mostra una possibile corrispondenza perfetta tra i due approcci per determinare le affinità composte per CAIX.I leganti più stretti del CAIX ricombinante, vale a dire gli inibitori VD11-4–2 e GZ18-23, hanno prodotto le curve con i punti medi di dosaggio intorno a 10 nM.Tuttavia, l'applicazione del modello di concorrenza ha prodotto i loro veri valori Kd intorno a 0,2 nM, che corrispondevano ai valori osservati per il legame composto al CAIX purificato ricombinante come determinato da TSA.Gli altri quattro inibitori hanno mostrato un'affinità molto più debole rispetto ai due inibitori CAIX più selettivi.Acetazolamide, un inibitore CA ampiamente utilizzato, ha prodotto il Kd di 15 nM, che era vicino al valore di 21 nM, ottenuto da TSA per il suo legame al CAIX ricombinante.Il composto SLC-0111 ha mostrato il Kd di 50 nM, vicino al valore di 100 nM, osservato per il suo legame al CAIX ricombinante (Tabella 2).L'SLC-0111 sembrava essere il legante più debole del CAIX espresso dalle cellule tra questi inibitori testati.La maggior parte dei composti si legava con affinità quasi identiche a entrambe le linee cellulari testate, HeLa e A549.Tuttavia, c'era una leggera ma riproducibile discrepanza per l'SLC-0111 che legava le cellule A549 più deboli delle cellule HeLa (l'esperimento è stato ripetuto tre volte).Per il confronto, abbiamo eseguito l'esperimento di competizione VD11-4-2 in camera ipossica senza esposizione cellulare alla normossia.Le curve competitive erano indistinguibili indicando che era adatto a far crescere le cellule per 72 ore in ipossia, mentre si eseguiva l'esperimento di competizione in normossia per 1,5 ore (Figura S4).La Figura 12C mostra la corrispondenza tra i valori Kd per il legame composto a CAIX ricombinante e CAIX sulla superficie cellulare.C'era un accordo relativamente buono tra i due metodi che determina l'affinità del composto per CAIX.Tuttavia, i composti VD11-4-2 e GZ18-23 avevano un'affinità inferiore al CAIX espresso in cellule rispetto al CAIX purificato.Questa differenza era probabilmente dovuta ad un tempo di permanenza piuttosto lungo, circa 5 h per VD11-4-233,34, e quindi al raggiungimento dell'equilibrio incompleto.Tuttavia, una corrispondenza complessivamente buona ha convalidato questo approccio per determinare le affinità composte per il CAIX espresso dalle cellule.Suggeriamo che questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per determinare le affinità di qualsiasi composto per CAIX cellulare che non è stato precedentemente testato per CAIX purificato ricombinante.Il GZ19-31 contiene una tetrafluorobenzensolfonammide para-sostituita che è un legante marginale di CAIX, ma riconosce CAI selettivamente e con alta affinità.Il GZ19-32 è un composto marcato con fluoresceina a base di VD11-4-2 che si lega selettivamente e con alta affinità a CAIX.Il GZ20-37 è un composto contenente sulfamidici metil sostituito privo del gruppo amminico e quindi incapace di legare fortemente CAIX, né altre isoforme di CA.Questo composto è una miscela di rapporto 1:1 di isomeri para e meta-sostituiti.Il GZ20-40 è analogo al GZ19-32, anch'esso progettato per riconoscere CAIX, ma contiene un linker più lungo tra il gruppo della testa e la fluoresceina.Gli spettri NMR composti GZ19-32 e GZ19-33 1H e 19F sono mostrati nella figura S7.1,2,3,4,5-pentafluorobenzensolfonammide13 o 1,2,3,4,5-pentafluoro-6-(metilsolfonil)benzene35(4,7 mmol, 1 eq.), trietilammina (1,67 mL, 12 mmol, 2,6 eq. ) e acido 3-mercaptopropanoico (0,73 mL, 5,6 mmoli, 1,2 eq.) sono stati aggiunti a metanolo (50 mL).La reazione è stata fatta rifluire per 13 h, quindi evaporata a pressione ridotta.Il precipitato risultante è stato lavato con acqua e purificato mediante ricristallizzazione.Acido 3-((2,3,5,6-tetrafluoro-4-sulfamoilfenil)tio)propanoico (GZ18-21).La ricristallizzazione è stata ottenuta dall'acqua.Resa: 1,41 g, 83%;mp: 167–168 °C (lit.13 168–169 °C).soc.soc.